Luminal型与Basal-like型乳腺癌差异miRNAs的表达与预后分析

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作者: 赵明娟 1 刘江波 2 袁芊芊 3 邓通 1 黄桥 1 吴高松 3 方程 1

作者单位: 1. 武汉大学中南医院循证与转化医学中心(武汉 430071) 2. 河南科技大学第一附属医院甲状腺乳腺肿瘤外科(河南洛阳 471000) 3. 武汉大学中南医院甲状腺乳腺外科(武汉 430071)

关键词: miRNAs Luminal型乳腺癌 Basal-like型乳腺癌 生存分析

DOI:10.12173/j.issn.1004-5511.202101059

基金项目: 中央高校基本科研业务费专项资金资助(2042019kf0173)

引用格式:赵明娟, 刘江波, 袁芊芊, 邓通, 黄桥, 吴高松, 方程. Luminal型与Basal-like型乳腺癌差异miRNAs的表达与预后分析[J]. 医学新知. DOI: 10.12173/j.issn.1004-5511.202101059.

摘要|Abstract

目的  分析Luminal型和Basal-like型乳腺癌之间差异表达的microRNAs (miRNAs),并探讨其表达水平与Luminal型和Basal-like型乳腺癌预后的关系。方法  从基因表达综合数据库(GEO)中下载包含Luminal和Basal-like乳腺癌患者相关的miRNAs微阵列数据集GSE81000与GSE40267,利用GEO2R在线分析工具筛选Luminal和Basal-like乳腺癌之间差异表达的miRNAs,再通过mirDIP数据库预测其靶基因,并采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)在人乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-468中验证miRNAs的差异表达。最后利用METABRIC数据库,采用Kaplan-Meier Plotter在线工具分析miR-199a-5p和miR-199b-5p表达水平与Luminal型和Basal-like型乳腺癌预后的关系。结果  筛选出了35种在Luminal型和Basal-like型乳腺癌中差异表达的miRNAs。相较于Luminal型,18种miRNAs在Basal-like型中表达下调,17种表达上调。靶基因预测结果显示,35种差异表达miRNAs的潜在靶基因共4 180个,其中最相关的靶基因有19个,且其对应的差异miRNAs为:miR-199a-5p、miR-199b-5p。相较于Luminal型乳腺癌,miR-199a-5p和miR-199b-5p在Basal-like型乳腺癌中表达下调。qRT-PCR检测结果表明,miR-199a-5p和miR-199b-5p在MCF-7(Luminal型)和MDA-MB-468(Basal-like型) 细胞中的表达水平与GEO2R分析结果趋势一致。生存分析结果表明, miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达与Luminal A型乳腺癌患者的总生存率降低显著相关。结论  共筛选出35个在Luminal型和Basal-like型乳腺癌中差异表达的miRNAs。其中,miR-199a-5p、miR-199b-5p与乳腺癌的预后相关,有望成为其治疗的新靶点。

全文|Full-text

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一,2020年世界卫生组织国际癌症研究机构(IARC)最新发布的全球癌症负担数据表明,全球乳腺癌新发病例高达226万例,超过了肺癌,成为全球第一大癌[1-2]。2012年我国新诊断乳腺癌占全球的12.2%,死亡病例占全球的9.6%,该数据源于中国国家癌症登记中心,只有13%的中国人口被纳入,可能低估了我国乳腺癌发病率和死亡率[3]。美国癌症协会最新的统计显示,乳腺癌发病率以每年0.3%的速度缓慢增长,主要为Luminal 型乳腺癌[4]。

近年来,人们尝试采用各种高通量分子技术探究乳腺癌的内在本质,根据其分子特征进行分类、治疗及预后评估,其中基因表达谱技术的应用最受关注。Perou等于2000年首次通过基因表达谱聚类分析方法,将乳腺癌分为管腔上皮 A 型 (Luminal A)、管腔上皮 B 型 (Luminal B)、HER-2 过表达型、基底样型 (Basal-like) 和正常乳腺样型 (Normal-like) 5种分子类型。此后,研究者开发了很多简化模式如PAM50和SCMGENE等,来增强分子分型的实用性[5-7]。2011年St.Gallen专家组达成共识,采用雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)、人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor-2, HER2)、Ki67 四种免疫组化标记来进行乳腺癌分子分型,将乳腺癌分为Luminal A型、Luminal B型、HER-2 过表达型及三阴性乳腺癌 (TNBC)[8-9]。之后的临床研究,证实了它们在预后和治疗反应等方面的特异性,受到越来越广泛认可。不同的分子分型在乳腺癌的治疗和预后上存在一定的差异,其中Luminal A型乳腺癌预后最好,Luminal B型次之,Basal-like型乳腺癌预后最差[8-9]。

微小RNA(microRNA, miRNA)是一类长约22个核苷酸组成的非编码单链RNA分子,通过与靶基因mRNA互补结合,从而参与基因表达转录后的调控[10]。有研究表明,miRNA的表达水平与乳腺癌的免疫组化、分子分型、预后及治疗反应密切相关[11]。Shin等发现miR-199a-5p在三阴性乳腺癌组织中表达低于正常乳腺组织[12]。而Bockmeyer等采用聚类分析方法发现,相较于Luminal型乳腺癌,Basal-like型乳腺癌在miR-199a-3p中表达水平明显上调[13]。在临床上,Basal-like型乳腺癌较Luminal型乳腺癌药物反应性和预后差,且易侵袭和转移。为了探讨Luminal型乳腺癌和Basal-like型乳腺癌间是否存在差异miRNAs导致这种差别,本文拟通过生物信息学方法,系统全面获取和分析Luminal 型和Basal-like型乳腺癌之间差异表达的miRNAs,以期能找到在这两类预后相差较大的乳腺癌中最相关的miRNAs。为以后两类分子分型乳腺癌,尤其是Basal-like型乳腺癌的诊断和治疗方面提供依据。

1 资料与方法

1.1 获取表达谱芯片数据

在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中,以“microRNAs”和“breast cancer”为检索词进行检索,并按照以下纳入与排除标准进行筛选。纳入标准:①miRNAs物种为人类;②数据集中必须同时包含Luminal型和Basal-like型乳腺癌样本;③数据集根据PAM50划分乳腺癌的分子分型。不同数据集、相同基因平台时,取样本量最大最全者。最后共纳入2个数据集GSE81000与GSE40267,分别由芯片平台GPL10656与GPL10850提供注释信息。筛选并下载2个数据集中Luminal型和Basal-like型的乳腺癌miRNAs微阵列数据集,其中GSE81000中Luminal型乳腺癌244例,Basal-like型乳腺癌45例; GSE40267中Luminal型和Basal-like型乳腺癌分别为20例和94例。

1.2 筛选差异表达的miRNAs

利用GEO2R在线分析工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/?),分析Luminal型和Basal-like型2组乳腺癌的微阵列数据,以P<0.05且差异倍数(fold change, FC)的绝对值≥1.5作为差异表达miRNAs的筛选标准。使用Venn diagram webtool(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)筛选两个数据集共同相交的miRNAs。两个数据集共同的差异miRNAs被视为关键miRNAs。

1.3 差异表达miRNAs的靶基因预测

利用miRNAs靶基因预测数据库mirDIP[14](http://ophid.utoronto.ca/mirDIP/index.jsp#r)在线预测2组乳腺癌差异表达miRNAs的潜在靶基因,并根据Integrated Score值≥0.9筛选最相关的靶基因。

1.4 实时荧光定量PCR检测差异表达miRNAs

人乳腺癌细胞系MCF-7与MDA-MB-468 来源于ATCC,采用10%胎牛血清的DMEM培养基于37℃恒温孵箱中培养,选择处于对数生长期的细胞进行实验。采用TRIZOL分别提取MCF-7细胞与MDA-MB-468细胞的总RNA。利用反转录试剂盒(ELK Biotechnology)生成cDNA模板,再采用qRT-PCR试剂盒(ELK Biotechnology)检测差异miRNAs的相对表达水平,以U6基因的mRNA作为内参基因。hsa-miR-199a-5p正向引物序列5'-CCCAGTGTTCAGACTACCTGTTC- 3',反向引物序列5'-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC-3';hsa-miR-199b-5p正向引物序列5'-CCCAGTGT TTAGACTATCTGTTCCT-3',反向引物序列5'- CTCAACTGGTGTCGTGGAGTC- 3'。PCR扩增条件:预变性95℃、3 min;循环段,95℃、10s,58℃、30s,72℃、30s,循环40次。数据采用2-ΔΔCT 法进行分析。

1.5 不同分子分型乳腺癌差异表达miRNAs的生存分析

利用METABRIC数据库(http://www.cbiopor tal.org/study/summary?id=brca_metabric),对Breast cancer miRNA中979例 Luminal型乳腺癌组织样本(其中Luminal A型546例,Luminal B型433例)和203例Basal-like型乳腺癌组织样本,在hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-199b-5p中的差异表达进行生存分析。

1.6 统计分析

通过R语言的Pheatmap包对筛选出来最相关靶基因进行可视化分析。采用SPSS 20.0统计学软件处理PCR数据,两组间采用独立样本t检验,以P<0.05具有统计学差异。对METABRIC数据库中筛选样本采用Kaplan-Meier Plotter(http://kmplot.com/analysis/index.php?p=service&cancer=breast_mirna)进行生存分析,针对所有可能值分组进行Cox回归,将最小P值对应的分界值确定为最佳cut off 值,P<0.05具有统计学差异。

2 结果

2.1 差异表达miRNAs获取

采用GEO2R分析工具,根据筛选标准,从数据集GSE81000与GSE40267中共筛选出896 条差异miRNAs,其中人源miRNAs 878条,最终在两个数据集中筛选出35种关键miRNAs,详见图1。相较于Luminal型乳腺癌,有18种miRNAs在Basal-like型患者中表达下调,而17种miRNAs表达上调(表1)。

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图1 两个数据集差异表达miRNAs韦恩图
Figure 1. Venn diagram of differential expression of miRNAs in two data sets

表1  利用GEO2R在线分析工具筛选获得差异表达的关键miRNAs
Table 1. The Key differentially expressed miRNAs were screened by GEO2R online analysis tool

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2.2 差异表达miRNAs的靶基因预测

靶基因预测数据库mirDIP检索并筛选结果显示,35种关键miRNAs的潜在靶基因共4 180个,最相关的靶基因有19个,其中5个靶基因(SLC24A3、MYRF、PODXL、CELSR1、CAPRIN1)由miR-199a-5p与miR-199b-5p共同靶向。使用R语言Pheatmap包进行可视化分析,结果如图2所示。

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图2  利用靶基因预测数据库mirDIP预测差异表达miRNAs的最相关靶基因结果
Figure 2. The most relevant target genes of predicted differentially expressed miRNAs by target gene prediction database mirDIP

2.3 实时荧光定量PCR检测差异表达miRNAs

采用qRT-PCR检测人乳腺癌细胞MCF-7(Luminal型)和MDA-MB-468(Basal-like型)细胞中miR-199a-5p与miR-199b-5p的表达水平。与MCF-7细胞相比,MDA-MB-468细胞中miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平均呈下降趋势,但差异不具有统计学意义(P>0.05)。

2.4 不同分子分型乳腺癌生存分析

利用METABRIC数据库分析546例Luminal A型、433例Luminal B型及203例Basal-like型乳腺癌组织样本中miR-199a-5p和miR-199b-5p的表达水平与患者总体生存率的关系,发现miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平与不同分子分型乳腺癌的预后具有相关性。在Luminal型乳腺癌患者中,miR-199a-5p(P=0.0031,cut off值为9.26)与miR-199b-5p(P=0.00061,cut off值为9.23)低表达与Luminal A型乳腺癌患者的总生存率降低相关,具有统计学差异,生存分析结果见图3A和图3B。而在Luminal B型乳腺癌中无统计学意义,详见图3C和图3D。尽管在Basal-like型乳腺癌患者中,miR-199a-5p与miR-199b-5p表达与其预后相关性无明显统计学差异(P>0.05),但在miR-199a-5p与miR-199b-5p高表达的Basal-like型乳腺癌患者总生存率的整体趋势高于低表达的患者,生存曲线见图3E和图3F。

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图3  A、C和E分别表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199a-5P中表达水平
与预后生存率的关系;图3 B、D和F分别表示Luminal A型、Luminal B型和Basal-like型乳腺癌在miR-199b-5P中表达水平与预后生存率的关系

Figure 3. Kaplan–Meier overall survival analyses for the miR-199a-5p expressed in the (A) Luminal A, (C) Luminal B, (E) Basal-like breast cancer patients,and the miR-199b-5p expressed in the (B) Luminal A, (D) Luminal B, (F) Basal-like breast cancer patients

3 讨论

乳腺癌在分子水平具有高度异质性,不同分子分型的乳腺癌患者对治疗反应各不相同。4种主要分子分型的乳腺癌患者预后有显著差异,其中Luminal A型乳腺癌预后最好, Basal-like型乳腺癌预后最差。乳腺癌的早期诊断对改善预后至关重要。随着医学技术的发展,分子生物标记物如ER、PR和HER-2,已充分用于诊断和预测肿瘤预后[15]。但这些生物标志物存在一定局限性,不能从外周血直接获取。

miRNA可以调控细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤微环境、侵袭和迁移,在乳腺癌的发生和发展中具有重要作用 [16-17]。再加上miRNA在血液中的稳定性、无创性、特异性和可测量性[18-19],使其成为乳腺癌诊断、治疗和预后预测理想的生物标志物。不同于以往的小样本研究,本研究整合了来自不同人群的2个miRNA微阵列数据集,通过生物信息学方法分析Luminal 型和Basal-like型乳腺癌之间差异表达的miRNAs。最终筛选出35种差异表达的关键miRNAs。其中18种miRNAs 在Basal-like型乳腺癌相较于Luminal型乳腺癌中表达下调,17种表达上调。靶基因预测获得潜在靶基因共4 180个,最相关的靶基因有19个,与其密切相关的miRNAs是miR-199a-5p和miR-199b-5p。采用qRT-PCR检测其在乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-468细胞表达水平,结果显示与MCF-7细胞相比,MDA-MB-468细胞在miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平均呈下降趋势。目前虽然也有研究表明miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达与乳腺癌总生存率显著降低相关,但研究多聚焦在三阴乳腺癌(TNBC)[20-23]。TNBC乳腺癌并不等同于Basal-like乳腺癌,TNBC乳腺癌中还包含20% Non-basal-like乳腺癌[24]。因此,miR-199a-5p和miR-199b-5p表达水平与Basal-like乳腺癌和Luminal乳腺癌预后关系尚未得到评估。本研究侧重于探讨miR-199a-5p和miR-199b-5p的表达水平与Basal-like和Luminal型乳腺癌患者预后的关系。生存分析结果显示,miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达与Luminal A型乳腺癌患者的总生存率降低显著相关。而Luminal B型乳腺癌患者预后却与miR-199a-5p与miR-199b-5p表达水平无关。尽管无统计学差异,Basal-like型乳腺癌患者总生存率在miR-199a-5p与miR-199b-5p低表达时亦呈现降低的趋势。有研究表明,miR-199a-5p可靶向Ets-1(E-Twenty-Six-1)的3'-UTR降低β1整合素水平,从而通过FAK/Src/Akt/mTOR信号通路减轻乳腺癌的侵袭[25]。Lin等研究发现miR-199b-5p具有抗血管生成作用,通过直接靶向激活素受体样激酶1(Activin Receptor- Like Kinase 1, ALK1),提示miR-199b-5p可能是一个潜在的抗血管生成的乳腺癌治疗靶点[26]。

总之,本研究通过生物信息学分析,确定了35个在Luminal 型和Basal-like型乳腺癌中差异表达的关键miRNAs,可能在乳腺癌的个体化治疗中发挥重要作用。其中,miR-199a-5p、miR-199b-5p与Luminal A型乳腺癌的预后相关,有望成为其治疗的新靶点。相关miRNA在乳腺癌分子分型中的调控机制有待进一步研究。

利益冲突 本研究所有作者均无利益冲突。

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